שיטת כרומטוגרפיה מתקדמת זאת המכונה High Pressure Liquid Chromatography מיועדת להפרדת תערובת נוזלית בקולונה. HPLC  הינה שיטה נפוצה ביותר בתחומה העומדת על כ 80% ונחשבת מדויקת ביותר. יתרונה המרכזי ביכולתה לזהות ולהפריד מרכיבים רבים ואף בכמויות זעירות באופן סימולטני וזאת עד לכדי מאות. לכן, שיטה זאת משמשת בתעשיות שונות כגון תעשיית התרופות, נפט ואף קפה התובעניות בדרישותיהן.

כמה מילים כיצד פועלת כרומטוגרפיה

בכל שיטות הכרומטוגרפיה עושים שימוש בשני אלמנטים קבועים: פאזה נעה ופאזה נייחת. הפאזה הנעה הינה נוזל או גז המזרים את החומר הנבדק על גבי הפאזה הנייחת. הפאזה הנייחת או הפאזה הנחה, מכילה תכונה פיזיקלית כלשהי הגורמת להתנגדות של אלמנט מסוים בחומר הנבדק. זה יכול להיות מטען חשמלי, מסה, גודל, או תכונות ביולוגיות. ההתנגדות במערכת הבדיקה משפיעה על אלמנטים מסוימים יותר וגורמת לפירוק של התערובת.

כרומטוגרפיה מתבצעת בדרך כלל בצינור, אך גם על גבי נייר ובדרך כלל מחובר למערכת הבדיקה חיישן האוסף נתונים לעיבוד.

קבלו מספר סוגי כרומטוגרפיית HPLC

כרומטוגרפיית ספיחה / פאזה נורמלית – מדובר באחת השיטות הוותיקות בקטגוריה זאת. בשיטה זאת נוצרית הפרדה על בסיס רמת הפולריות (קוטביות) של חומרים. האלמנט הכימי המוצמד לדפנות הקולונה בעל תכונות הידרופיליות דבר שמשפיע על הנוזל העובר דרכו. לפיכך ככל שהאלמנטים בנוזל יותר הנבדק יותר הפולריים כך יתעכבו יותר בתנועתם. כתוצאה מכך יגיעו לקצה הקולונה אלמנטים מבודדים וזאת על פי סקאלה של פולאריות מהקל לכבד.

כרומטוגרפיית פאזה הפוכה – בדיוק אותו דבר כמו פאזה נורמלית רק הפוך. הפעם הפאזה הנחה הינה הידרופובית.

כרומטוגרפית הדרת גודל (SEC) – המכונה גם כרומטוגרפיית סינון בג'ל. הג'ל בכרומטוגרפייה זאת ודומותיה הינו תמיסת כדורים ג'לטינית. הכדורים מכילים חריץ ואליו מוצמדת הפאזה הנייחת כשזאת בעלת תכונות פיזיקליות/כימית/ביולוגיות מאטות. בכרומטוגרפייה זאת מבצעת הפרדה באמצעות סינון על פי נפחה של המולקולות בתערובת (רדיוס סטוקס). כרומטוגרפיה זאת משמשת לליטוש אחרון. כמו כן, פרוצדורה זאת שימושית קביעת מבנה שלישוני ומבנה הרביעון של חלבונים מטוהרים.

כרומטוגרפיית זיקה (Affinity) – בדומה לכרומטוגרפיית SEC עושים בפרוצדורה זאת שימוש בג'ל כדוריות. הפעם קושרים קובלנטית לכדוריות ליגנד (חומר בעל זיקה גבוהה לחומר המטרה). בכרומטוגרפיה זאת יוצרים תחרות קשרים לא קוולנטיים בין החומר הנבחן (בדרך כלל חלבון) לליגנד כמו גלוקוז או נוגדן. כתוצאה מכך, חומר המטרה מתעכב בקולונה ואילו השאר זורם ויוצא יחד עם נוזל הבאפר (פאזה נעה). בטכנולוגיה זאת עושים שימוש עבור בידוד מולקולות ביולוגיות וכימיות שלא מעוניינים לפגוע במבנה שלהם. כמו כן, טכנולוגיה זאת אפקטיבית גם לדילול חומר מסוים וכן בידוד והפרדת מולקולה מסוימת על פי תכונה.

כרומטוגרפיית מטען/חילוף יונים (IEC) – גם פה נעשה שימוש בג'ל שמוצמדת אליו הפאזה הנייחת והפעם מדובר במולקולה טעונה או יון. גם טכניקה זאת משמש להפרדה ולא לאנליזה. האלמנט שקובע את התנהגות הדוגמית במערכת זאת הינה מידת הPH  של תמיסת הבאפר (פאזה נעה) שיהיה בעל מטען הפוך לזה שיש בפאזה הנחה. במצב זה חלבונים הנעים בקולונה טעונים חשמלית על פי הסביבה הכימית הנקבעת בתמיסת הבאפר וינהלו אינטרקציה בהתאם עם הפאזה הנחה המוצמדת לחרוזים.

שיטת כרומטוגרפיה זאת נחלקת לשני סוגים:

• כרומטוגרפיה שהפאזה הנחה בה בעלת מטען שלילי ותמשוך אליה חלבונים חיוביים.
• כרומטוגרפיה בעלת מטען חיובי שתמשוך אליה חלבונים בעלי מטען שלילי.

לצורך חילוץ חומר המטרה שלנו נוכל לשטוף את התמיסה במלח ולשנות את ה PH  בכך ניצור תחרות על ה"מגנטים" הכימיים בפאזה הנייחת. לחלופין, ניתן לשטוף את הקולונה בתמיסה המכילה מטען השווה לחומר המטרה ולמסך את הפאזה הנייחת.